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Que peuvent révéler les images Raman

Les images Raman peuvent montrer la distribution des espèces chimiques et structurelles dans un échantillon. Apprenez à collecter et à analyser des images Raman.

Les images Raman, parfois appelées cartes, montrent la distribution spatiale des informations spectrales de l’échantillon. On utilise un microscope Raman pour collecter les informations spectrales à partir d’une matrice de points sur ou dans un échantillon. L’imagerie Raman peut facilement montrer des variations des propriétés chimiques et structurelles avec une position sous forme de profils 1D, de zones 2D ou de volumes 3D.

Que nous apprennent les images Raman ?

Les informations spectrales de chaque pixel d’une image Raman permettent de déterminer les informations suivantes :

  • la présence d’un matériau ou d’une espèce
  • si des matériaux inconnus sont présents
  • la distribution du matériau ou de l’espèce
  • la taille des particules ou des domaines
  • les quantités relatives de matériaux ou d’espèces
  • les variations structurelles d’un matériau, comme la cristallinité ou l’état de contrainte
  • l’épaisseur et la composition des matériaux en couches, comme les laminés polymères, d’une épaisseur allant du micromètre au millimètre
Images de lessive en poudre en lumière blanche et Raman

Images de lessive en poudre en lumière blanche et Raman. Les images Raman montrent des domaines chimiquement différents qui ne sont pas visibles sur l’image en lumière blanche.

Imagerie Raman qualitative et quantitative

Les images Raman en fausses couleurs sont un moyen puissant de mettre en évidence la distribution des propriétés chimiques et structurelles d’un échantillon. La luminosité, le contraste et la couleur de l’image peuvent aider à représenter la composition du matériau. En superposant des images Raman individuelles, on peut afficher simultanément la distribution de plusieurs espèces ou propriétés.

Plaquette de SiC

Image Raman d’une plaquette de SiC. La surface de l’image est d’environ 1 mm2, et montre des inclusions de carbure de silicium 6H, de carbure de silicium 3C ou de Si (en rouge), ainsi que des vides (en noir). La distribution des déformations est représentée en bleu et en vert.

Image Raman binarisée du montélukast sodique Image Raman du principe actif montélukast sodique dans un comprimé oral. Les domaines du principe actif sont représentés en différentes couleurs pour faciliter la visualisation.

On peut également analyser les images Raman pour obtenir des données quantitatives. Celles-ci comprennent des statistiques sur les particules, telles que le nombre de particules, leur forme ou leur taille. On peut ainsi quantifier les images Raman à l’aide de mesures objectives pour une comparaison directe.

Comment collecter des images Raman ?

Des spectres Raman sont collectés à l’aide d’un microscope Raman pour chaque position de l’échantillon. Les spectres Raman sont ensuite enregistrés dans un fichier de données, dénommé hypercube spectral. Cet hypercube spectral est enfin analysé pour produire des images Raman.


Il existe plusieurs techniques d’imagerie Raman, dont voici quelques exemples :


Focalisation ponctuelle
Le microscope Raman focalise le laser sur un point de l’échantillon. L’échantillon est placé sur une platine motorisée qui le déplace sous le laser. Le spectromètre collecte des spectres à partir d’une matrice de points de l’échantillon.

L’imagerie à focalisation ponctuelle est disponible en versions rapides grâce aux technologies d’imagerie StreamHR™ et StreamHR™ Rapide de Renishaw. L’imagerie Raman combinée à la technologie StreamHR Rapide peut acquérir plus de 1 000 points spectraux par seconde.

Échantillonnage et sous-échantillonnage optimaux



Figure illustrant une imagerie point par point, décrivant à la fois une imagerie optimale et un sous-échantillonnage.

Focalisation linéaire
Le laser illumine une ligne sur l’échantillon, plutôt qu’un point. Cette méthode permet de collecter simultanément des spectres à partir de plusieurs positions sur l’échantillon, ce qui se traduit par un gain de temps notable. Cette méthode permet d’utiliser des puissances laser totales plus élevées sans endommager l’échantillon. Chez Renishaw, ce concept est mis en œuvre à l’aide de la technologie d’imagerie StreamLine™, à la fois moderne et sophistiquée. Avec l’imagerie à focalisation linéaire, le laser éclaire une ligne verticale sur l’échantillon plutôt qu’un point.


Pendant l’imagerie, il est important de prendre en compte les effets potentiellement indésirables du sous-échantillonnage. Le sous-échantillonnage se produit lorsque la ligne ou le point laser est plus petit que l’espacement entre les points d’acquisition. Renishaw a résolu ce problème grâce à la technologie StreamLine dotée du mode Slalom.

StreamLine™ Slalom

La technologie d’imagerie StreamLine dotée du mode Slalom garantit une couverture complète de l’échantillon, même avec de grandes tailles de pas (pixels). Elle permet de réaliser une imagerie Raman rapide de grands échantillons sans rien manquer.

Technologie StreamLine pour une imagerie Raman rapide et souple

Le système balaye la ligne laser sur l’axe y de l’échantillon. Le capteur CCD collecte simultanément des données à partir de plusieurs points de l’échantillon.

La taille de pas en x est égale à la largeur de la ligne laser. Cette méthode permet d’obtenir une couverture complète, mais pas aux vitesses maximales.

Sous-échantillonnage sans mode Slalom

La taille de pas en x est supérieure à la largeur de la ligne laser. La ligne laser ne balaye pas entre les pixels, si bien que le spectromètre n’analyse pas certaines zones de l’échantillon. Sur la figure, le système ne collecte des données que sur environ 20 % de l’échantillon.

Technologie StreamLine avec mode Slalom pour une couverture rapide et complète

Le mouvement en zigzag de la ligne laser balaie les zones de l’échantillon situées entre les pixels. Cela permet d’obtenir une taille de pas en x supérieure à la largeur de la ligne laser.

Le spectromètre collecte alors des données sur 100 % de l’échantillon aux vitesses maximales.

Côlon de rat





Image Raman montrant l’organisation des tissus à l’intérieur d’une crypte du côlon d’un rat sain. Une PCA a été utilisée pour créer cette image.

Comment analyser les images Raman ?

On peut analyser les spectres Raman d’un essai d’imagerie afin d’obtenir des profils 1D, des images 2D ou des volumes rendus en 3D. L’image Raman peut montrer de simples paramètres de bande univariés tels que l’intensité d’une bande Raman. On peut également utiliser une analyse multivariée complète de l’ensemble du spectre Raman à travers l’hypercube spectral.


Le logiciel WiRE™ de Renishaw offre de nombreuses options d’analyse de données pour l’imagerie Raman :

Intensité à une fréquence du spectre
Ces images sont rapides à générer, mais peuvent être trompeuses. Cette méthode ne permet pas de différencier les intensités provenant d’une bande Raman d’intérêt de celles associées à une large fluorescence d’arrière-plan.

Paramètres d’ajustement de courbe
Pour chaque spectre d’une image Raman, vous pouvez ajuster une courbe théorique pour chaque bande Raman. Vous pouvez calculer les paramètres de la bande Raman tels que le décalage Raman, la largeur de la bande ou l’intensité relative. Les images Raman montrent souvent des variations dans le décalage Raman d’une bande, ce qui peut indiquer une contrainte localisée. Elles peuvent également montrer des variations dans la largeur de la bande Raman, ce qui peut indiquer différents degrés de cristallinité.

Paramètres multivariés
L’analyse multivariée est très puissante, car elle utilise des informations provenant de l’ensemble du spectre, et pas seulement d’un paramètre de la bande Raman (p. ex. l’intensité à une fréquence ou une bande ajustée à la courbe). Il en résulte généralement des images Raman de meilleure qualité, avec une meilleure spécificité chimique.

Si l’on dispose de spectres de référence pour les composants chimiques de votre échantillon, on peut facilement créer des images Raman montrant leur distribution. Dans ce cas, on utilisera des méthodes d’analyse des composants telles que les moindres carrés classiques directs (DCLS) ou les moindres carrés non négatifs (NNLS). On peut utiliser ces méthodes d’analyse des composants pour obtenir des estimations quantitatives de la concentration.

Si aucun spectre de référence n’est disponible, on peut créer des images Raman à l’aide de méthodes chimiométriques non supervisées. Il s’agit notamment de l’analyse en grappes, de l’analyse en composantes principales (PCA) ou de la fonction logicielle EmptyModelling™ de Renishaw. On peut utiliser ces méthodes chimiométriques sans savoir ce que contient l’échantillon. Ces méthodes analysent la variance systématique entre les spectres Raman afin de prédire les composantes spectrales. Une image Raman montre alors la distribution des composantes spectrales dans l’échantillon.

On utilise souvent l’analyse en grappes et la PCA pour analyser les images Raman de tissus biologiques et de cellules. Ces méthodes chimiométriques puissantes permettent de détecter des structures dans les échantillons biologiques qui ne contiennent souvent aucun produit biochimique pur.

La fonction EmptyModelling est une version conviviale de l’analyse des moindres carrés alternés à résolution de courbes multivariées (MCR-ALS). Cette méthode permet de créer des images Raman d’échantillons qui identifient des régions inconnues de composants purs. Cette méthode est importante pour les échantillons tels que les plaquettes de semi-conducteurs ou les formulations pharmaceutiques.

Ces fonctions avancées d’analyse des données font toutes partie de l’ensemble chimiométrique du logiciel WiRE. Ces méthodes sont destinées à un usage immédiat sans aucune programmation.
 

La spectroscopie Raman

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Qu’est-ce que la spectroscopie Raman ?

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Spectroscopie Raman expliquée