Surmonter les limites de la spectroscopie Raman
Quelques solutions simples vous permettent d’obtenir les meilleures données Raman possibles. Envisagez d’utiliser la SERS ou la TERS pour améliorer la sensibilité et la résolution spatiale de la diffusion Raman.
La spectroscopie Raman est une technique analytique polyvalente de caractérisation chimique et structurelle. Examinons certains défis et inconvénients rencontrés lors d’une analyse Raman, ainsi que les solutions possibles. Voyons également les facteurs qui influencent la résolution spatiale. Pour obtenir une résolution spatiale de l’ordre du nanomètre, on peut utiliser la diffusion Raman exaltée par effet de pointe (Tip-Enhanced Raman Scattering, TERS).
Défis et considérations liés à l’application de la spectroscopie Raman
Malgré les nombreux avantages de la spectroscopie Raman, des défis pratiques peuvent parfois se présenter. Ces problèmes s’appliquent à tous les instruments Raman. Nos solutions et conseils pratiques vous permettent toutefois d’optimiser votre système Raman.
En voici quelques-uns.
1. L’effet Raman est relativement faible
Les systèmes Raman de Renishaw ont recours à des conceptions optiques très efficaces et à des détecteurs ultra-sensibles.
2. Des arrière-plans de fluorescence importants peuvent masquer les bandes Raman
L’utilisation d’un système multilaser permet de passer à une longueur d’onde d’excitation différente. Par exemple, le passage d’un laser visible à un laser proche de l’infrarouge (p. ex. 785 nm) réduit généralement la fluorescence. Cela améliore vos chances de produire des spectres avec des bandes Raman claires.
3. De nombreuses surfaces d’échantillons ne sont pas planes
Dans le passé, l’imagerie Raman sur des échantillons irréguliers s’avérait difficile. Désormais, grâce à la technologie de suivi de la mise au point LiveTrack, les microscopes Raman Renishaw restent automatiquement au point pendant la collecte des données. Vous pouvez facilement suivre les variations chimiques et structurelles en fonction de la topographie.
4. Les récipients en verre et les lames de microscope peuvent masquer les bandes Raman de vos échantillons
a. Remplacez les lames en verre par des lames en acier inoxydable.
b. Pour les cellules biologiques, utilisez des lames de microscope polies « miroir » en acier inoxydable, CaF2 ou MgF2.
c. Remplacez les récipients en verre standard par des récipients en quartz, qui produisent un arrière-plan plus faible à 785 nm.
5. Les récipients et les substrats peuvent contribuer à votre spectre.
Vous pouvez contrôler le degré de confocalité sur le microscope confocal Raman inVia™ et l’analyseur Raman Virsa™. Combinez un objectif de microscope à grande ouverture numérique (NA) avec un réglage d’instrument hautement confocal pour minimiser le volume d’échantillonnage. Cela permet de contrecarrer toute contribution d’arrière-plan indésirable due aux matériaux du substrat ou du récipient.
Pour analyser un échantillon en vrac dans un récipient transparent, vous pouvez utiliser un objectif à faible NA pour faire la mise au point dans le récipient. Cela permet de maximiser le signal Raman du matériau d’intérêt et de minimiser les contributions spectrales du récipient.
6. Les puissances laser élevées peuvent endommager les échantillons
On utilise des lasers pour générer une diffusion Raman. Le signal Raman est proportionnel à la puissance du laser, si bien qu’une puissance plus élevée produit généralement un signal plus fort.
Cependant, tous les échantillons ont un seuil de densité de puissance laser au-delà duquel des variations structurelles ou chimiques peuvent se produire. Voici nos solutions :
a. Conception de spectromètres à haut rendement : il est possible d’obtenir les signaux Raman les plus élevés avec des puissances laser très faibles.
b. La puissance du laser est répétable et contrôlée par logiciel. Ainsi, vous pouvez être sûr que votre échantillon n’a subi aucune variation.
c. Répartissez la puissance laser incidente sur une plus grande surface à l’aide du mode de focalisation linéaire. Pour ce faire, utilisez un microscope inVia, un analyseur pharmaceutique RA802 et un analyseur biologique RA816.
7. Supprimez automatiquement les caractéristiques des rayons cosmiques avec le logiciel WiRE™.
Les rayons cosmiques sont des particules hautement énergétiques qui proviennent des régions situées au-delà de l’atmosphère terrestre. Si des rayons cosmiques frappent un détecteur pendant la collecte de données, des pics de haute intensité apparaissent dans les spectres. Les grandes images Raman peuvent souvent contenir des milliers d’artefacts dus aux rayons cosmiques.
Le logiciel WiRE peut entièrement automatiser l’élimination des rayons cosmiques des grandes images Raman, qui contiennent jusqu’à 50 millions de spectres. On peut ensuite automatiser le flux de travail d’analyse des données afin de produire des résultats fiables.
Résolution spatiale d’une image Raman
Quelques facteurs déterminent la résolution spatiale d’un microscope Raman :
• Taille du spot laser
Elle est fonction de l’ouverture numérique (NA) de l’objectif et de la longueur d’onde du laser. En résumé, une NA plus élevée et des longueurs d’onde plus courtes produisent des spots plus petits.
• Espacement entre les points d’acquisition spectrale sur l’échantillon (échantillonnage)
Il est fonction de la platine de l’échantillon. La platine codée à grande vitesse MS30 de Renishaw a une grande plage de déplacement avec de petites tailles de pas allant jusqu’à 50 nm. Ces pas sont inférieurs à la plus petite taille de spot laser limitée par la diffraction.
• Grossissement de l’optique du spectromètre et taille des pixels CCD
Ces paramètres sont limités par la nature ondulatoire de la lumière, de l’ordre d’un peu moins d’un micromètre.
Équations permettant de calculer la taille du spot selon le principe de la limite de diffraction d’Abbe et la limite théorique de la résolution latérale pour un objectif de microscope et une longueur d’onde de lumière donnés.
La spectroscopie Raman
Vous êtes un nouveau venu dans la spectroscopie Raman ? Découvrez rapidement les principes fondamentaux de l’analyse Raman.
Diffusion Raman exaltée par effet de surface (SERS)
La diffusion Raman exaltée par effet de surface (Surface-Enhanced Raman Scattering, SERS) peut augmenter l’intensité de la diffusion Raman des molécules adsorbées sur les substrats SERS. Les substrats SERS peuvent être des surfaces métalliques rugueuses ou des nanoparticules métalliques colloïdales. Le signal peut être augmenté plus d’un milliard de fois dans certains cas. La SERS permet de détecter de très faibles concentrations de matériaux. Cette technique s’avère donc très efficace dans des domaines tels que la biodétection ou l’analyse médico-légale.
Deux effets peuvent être à l’origine de l’exaltation de la résonance de la diffusion Raman des molécules proches du substrat métallique SERS :
• Le métal peut amplifier les champs électriques de la lumière laser entrante et de la lumière Raman diffusée sortante
• Le métal peut modifier la répartition des charges à l’intérieur des molécules adsorbées, ce qui renforce la diffusion
Diffusion Raman exaltée par effet de pointe (TERS)
La diffusion Raman exaltée par effet de pointe (Tip-Enhanced Raman Scattering, TERS) est un type de SERS qui utilise une pointe à revêtement métallique pour exalter le signal Raman. La technique TERS renforce le signal Raman des molécules situées à quelques nanomètres de la pointe. Cette méthode permet de résoudre des particules de l’ordre du nanomètre. À titre de comparaison, la résolution spatiale limitée en diffraction de la diffusion Raman conventionnelle en champ lointain est >0,2 μm.
On peut utiliser la TERS pour l’imagerie chimique à super-résolution. Pour ce faire, on compare le spectre de la surface de l’échantillon avec et sans la pointe. La pointe TERS est généralement montée sur un microscope-sonde à balayage (SPM) ou un microscope à force atomique (AFM). Le microscope Raman inVia de Renishaw peut effectuer des mesures SPM/AFM sur site, y compris la TERS.
Le microscope combiné Raman-SPM/AFM de Renishaw est disponible avec des options TERS.
Image AFM d’une lamelle de graphène avec spectres Raman provenant de mesures en champ lointain et TERS. Le spectre Raman TERS permet de résoudre facilement la petite région de graphène monocouche. Le spectre Raman en champ lointain présente une bande 2D plus large, montrant une certaine contribution du graphène double couche situé à proximité.
Qu’est-ce que la spectroscopie Raman ?
Poursuivez votre exploration des spectroscopies Raman et par photoluminescence (PL). Nous répondons à vos questions sur la microscopie Raman, l’imagerie Raman rapide, l’analyse des données, la fluorescence et les techniques analytiques complémentaires.
Spectroscopie Raman expliquée